Nommé assistant director en 1915, il devient directeur par intérim à la mort de Percival Lowell en 1916, puis est officiellement nommé directeur de l'observatoire en 1926, poste qu'il occupe jusqu'en 1954. Sa carrière est marquée par une période particulièrement difficile après la mort de Lowell, le fondateur, alors que l'observatoire doit faire face à des batailles judiciaires avec la veuve de ce dernier pour la succession, ce qui impose à Slipher, en tant que directeur par intérim, une gestion financière extrêmement stricte. Outre ses fonctions scientifiques, il s'implique activement dans la communauté de Flagstaff, siégeant au conseil scolaire, participant à la fondation du Museum of Northern Arizona et gérant des propriétés et un magasin de meubles.

Les travaux de Slipher couvrent un spectre très large, allant du Système solaire aux confins de l'univers, avec une prédilection pour la spectroscopie. Sa première mission à Lowell est d'étudier les planètes du Système solaire. Dès 1903, il utilise un spectrographe pour tenter de mesurer la période de rotation de Vénus et démontre qu'elle est beaucoup plus longue que les 24 heures estimées jusqu'alors, une découverte confirmée bien plus tard avec une période de 243 jours. La même année, il mesure la rotation de Mars, puis celles de Jupiter, Saturne et, en 1911, d'Uranus, dont il est le premier à déterminer la vitesse de rotation. Il est également un pionnier de la spectroscopie infrarouge : il enregistre les spectres des planètes géantes et identifie des bandes d'absorption qui seront plus tard attribuées à l'ammoniac et au méthane.

En dehors du système solaire, Slipher réalise des découvertes fondamentales sur la nature du milieu interstellaire. En 1909, il observe des raies spectrales du calcium qui ne se déplacent pas avec les raies des étoiles binaires,ce qui prouve ainsi l'existence de gaz interstellaire, une hypothèse récente de Jacobus Kapteyn. Puis, en 1912, il étudie la nébuleuse entourant l'étoile Mérope dans les Pléiades et montre que son spectre est identique à celui de l'étoile, concluant qu'il s'agit de lumière réfléchie et découvrant par la même occasion la présence de poussière interstellaire.

Cependant, la contribution la plus célèbre de Slipher concerne l'étude des "nébuleuses spirales", que l'on appelle aujourd'hui les galaxies. En 1912, utilisant un spectrographe qu'il a lui-même assemblé sur le télescope de 24 pouces de Lowell, il se concentre sur la grande nébuleuse d'Andromède. Il est le premier à mesurer sa vitesse radiale grâce à l'effet Doppler et découvre avec stupeur qu'elle se rapproche de la Terre à environ 300 kilomètres par seconde, une vitesse alors inconnue pour un objet céleste. Il confirme ce résultat peu après avec une autre nébuleuse dans la Vierge, mais cette fois-ci, ses raies sont décalées vers le rouge, indiquant qu'elle s'éloigne à près de 1000 kilomètres par seconde. Entre 1912 et 1925, il accumule les spectres de 41 nébuleuses spirales et constate que la grande majorité d'entre elles présentent un décalage vers le rouge, c'est-à-dire qu'elles s'éloignent de nous. Ces mesures de vitesses radiales sont les premières preuves empiriques de l'expansion de l'univers, et serviront de base à Edwin Hubble en 1929 pour établir la relation entre la vitesse d'éloignement des galaxies et leur distance, connue aujourd'hui sous le nom de loi de Hubble-Lemaître. Il découvre également, en 1914, que certaines de ces nébuleuses (galaxies) sont en rotation.

Par ailleurs, Slipher est à l'origine de la découverte de la couche de sodium dans la haute atmosphère terrestre en 1929. Il joue aussi un rôle administratif clé dans la recherche de la "Planète X" prédite par Percival Lowell. C'est lui qui supervise le jeune Clyde Tombaugh et engage les travaux qui mèneront à la découverte de Pluton en 1930 .

La personnalité de Slipher est souvent décrite comme réservée, minutieuse et opposée à la spéculation, ce qui contraste avec l'enthousiasme de son employeur Percival Lowell. Cette prudence, couplée à l'ostracisme professionnel dont souffrait l'observatoire Lowell à cause des théories controversées de son fondateur sur Mars, explique pourquoi ses découvertes majeures n'ont pas été immédiatement reconnues du grand public. Néanmoins, ses pairs lui ont décerné les plus hautes distinctions : le prix Lalande de l'Académie des sciences de Paris en 1919, la médaille Henry Draper de l'Académie nationale des sciences en 1932, la médaille d'or de la Royal Astronomical Society en 1932 et la médaille Bruce en 1935. Il est élu membre de l'Académie nationale des sciences, de l'American Academy of Arts and Sciences et de l'American Philosophical Society. Vesto Slipher s'éteint le 8 novembre 1969 à Flagstaff, en Arizona, trois jours avant son 94^e anniversaire. Il repose au cimetière Citizens Cemetery de Flagstaff.