L'acétyl-CoA est un substrat dans le cycle de l'acide citrique (= cycle de Krebs). Dans ce cycle, l'acétyl-CoA entre, et ses atomes de carbone sont progressivement oxydés, générant des transporteurs d'électronsénergétiques (NADH et FADH2), qui sont ensuite utilisés dans la chaîne de transport d'électrons pour produire de l'ATP par phosphorylation oxydative. L'acétyl-CoA est, par ailleurs, un précurseur de la synthèse des acides gras. Contrairement à son rôle dans la production d'énergie, l'acétyl-CoA est un point de départ pour des processus anaboliques tels que la biosynthèse des lipides.

Dans certaines conditions, l'acétyl-CoA peut être converti en glucose par néoglucogenèse, fournissant ainsi un moyen de maintenir les niveaux de glucose sanguin.  L'acétyl-CoA est également impliqué dans la régulation épigénétique. Il sert de substrat pour les histones acétyltransférases (HAT), des enzymes qui ajoutent des groupes acétyles aux protéines d'histones. Ce processus peut influencer l'expression génique.