En 1886, sur recommandation du professeur Holden, Keeler fut nommé assistant auprès des administrateurs de l'observatoire Lick, nouvellement créé sur le mont Hamilton en Californie. Il arriva à cet observatoire le 25 avril 1886 et se consacra immédiatement à la mise en place du service de temps, perfectionnant la ligne télégraphique vers San José et installant les instruments de transit, les horloges et les appareils d'émission et de réception. Le 1^er juin 1888, lorsque l'observatoire fut achevé et transféré à l'Université de Californie, Keeler fut nommé astronome, rejoignant un personnel comprenant les astronomes Holden, Burnham, Schaeberle et Barnard. À Lick, Keeler fut chargé des travaux spectroscopiques et conçut un grand spectroscope stellaire qui demeura sans égal pour les observations visuelles. 

C'est avec l'instrument de 91 centimètres (36 pouces) de Lick que, le 7 janvier 1888, il fut le premier à observer une lacune dans les anneaux de Saturne, découverte qui fut éclipsée lorsque la caractéristique fut nommée d'après Johann Encke, qui avait observé une variation beaucoup plus large de la luminosité dans l'anneau A. La deuxième lacune majeure de l'anneau A, découverte par la sonde Voyager, fut nommée en son honneur "Keeler Gap". Parmi ses nombreux résultats à Lick, il observa les spectres de la nébuleuse d'Orion et de treize nébuleuses planétaires, et ses mesures des vitesses radiales de ces objets marquèrent une époque en spectroscopie visuelle, démontrant notamment que les vitesses des nébuleuses dans l'espace sont du même ordre de grandeur que celles des étoiles.

Keeler quitta Lick en 1891 pour devenir directeur de l'observatoire Allegheny de l'Université de Pittsburgh, poste qu'il occupa jusqu'en 1898. C'est à Allegheny qu'il réalisa l'Å“uvre pour laquelle il est le plus célèbre : une étude spectroscopique des anneaux de Saturne en 1895, utilisant un spectrographe fixé à la lunette réfractrice de 33 centimètres (13 pouces) Fitz-Clark. Cette étude révéla que différentes parties des anneaux réfléchissent la lumière avec des décalages Doppler différents en raison de leurs vitesses d'orbite distinctes autour de Saturne. Cette découverte constitua la première confirmation observationnelle de la théorie de James Clerk Maxwell selon laquelle les anneaux ne sont pas solides mais composés d'innombrables petites particules, chacune orbitant à sa propre vitesse. 

En 1898, Keeler retourna à l'observatoire Lick en tant que directeur, succédant à Edward S. Holden. Il y entreprit un vaste programme d'observation photographique des nébuleuses et des amas d'étoiles en utilisant le télescope Crossley, un réflecteur de 91 centimètres (36 pouces) récemment acquis. Ses observations avec cet instrument démontrèrent la supériorité des grands télescopes à réflexion pour photographier les objets célestes faibles et révélèrent que les galaxies spirales constituent le type de galaxie le plus courant dans l'univers observable. Il photographia des milliers de nébuleuses, dont beaucoup n'avaient jamais été suspectées auparavant, et établit leur relation étroite avec les étoiles. Keeler découvrit également deux astéroïdes : (452) Hamiltonia, un astéroïde de la famille Koronis, le 6 décembre 1899, et (20958) A900 MA, un astéroïde géocroiseur, le 29 juin 1900, ce dernier étant perdu puis redécouvert 99 ans plus tard. Après la découverte des pulsars en 1967, les images optiques de la nébuleuse du Crabe(constellation du Taureau) prises par Keeler en 1899 furent utilisées pour déterminer le mouvement propre du pulsar du Crabe.

En plus de ses travaux de recherche, Keeler fonda et codirigea avec George Hale la revue Astrophysical Journal, qui demeure l'une des principales revues d'astronomie aujourd'hui. Il fut élu président de la Société astronomique du Pacifique en 1900. Il reçut la médaille Henry Draper de l'Académie nationale des sciences en 1899 et le prix Rumford en 1898. Keeler souffrait d'une faiblesse cardiaque non diagnostiquée jusqu'à peu de temps avant sa mort. Il décéda subitement d'une attaque le 12 août 1900 à San Francisco, à l'âge de seulement 42 ans, laissant une veuve et deux enfants. Ses cendres furent déposées dans une crypte à la base du télescope Keeler Memorial de 79 centimètres (31 pouces) à l'observatoire Allegheny.