L'alchimie reste le cadre dominant de la réflexion sur la composition et la transformation des substances. Les alchimistes poursuivent l'objectif traditionnel de la transmutation des métaux vils en or, mais leurs travaux s'orientent de plus en plus vers des applications pratiques, notamment en médecine. Cette évolution s'inscrit dans un mouvement plus large, celui de la « chimie médicale » ou « iatrochimie », qui cherche à utiliser les substances chimiques pour guérir les maladies. Ce courant est particulièrement porté par Paracelse, un médecin, alchimiste et philosophe dont l'influence marquera profondément la chimie du XVI^e siècle. 

Paracelse rejette violemment la médecine galénique dominante, basée sur les quatre humeurs, et affirme que la santé dépend de l'équilibre chimique du corps. Il introduit l'idée que les maladies peuvent être traitées par des remèdes chimiques précis, tels que le mercure, le soufre ou l'arsenic, administrés en doses contrôlées. Pour lui, la chimie n'est pas une simple technique de laboratoire, mais une science fondamentale pour comprendre la nature et le corps humain. Il considère que Dieu a créé trois principes fondamentaux dans toutes les substances : le soufre (principe de combustibilité), le mercure (principe de volatilité et de fluidité) et le sel (principe de stabilité et de solidité). Ces « tria prima » remplacent la théorie des quatre éléments d'Aristote dans sa vision du monde. 

L'approche de Paracelse suscite à la fois fascination et polémique. Ses écrits, souvent provocateurs et mystiques, sont diffusés dans toute l'Europe grâce à l'imprimerie. De nombreux médecins et alchimistes s'inspirent de ses idées, notamment en Allemagne, en France et en Suisse. Son insistance sur l'expérimentation et l'observation directe préfigure une méthode plus scientifique, même si ses théories restent ancrées dans une vision du monde encore fortement influencée par l'hermétisme et la religion. 

Parallèlement, les progrès techniques dans la manipulation des substances se multiplient. Les alchimistes perfectionnent les techniques de distillation, de sublimation, de calcination et de cristallisation. Des fours, alambics et récipients en verre de plus en plus sophistiqués sont utilisés dans les laboratoires, souvent installés dans les châteaux, les monastères ou les maisons de médecins. L'étude des minéraux, des sels et des métaux devient plus systématique. Des ouvrages techniques, comme ceux de Georgius Agricola, apportent une contribution importante. Dans son traité De re metallica (1556), Agricola décrit en détail les méthodes d'extraction et de traitement des minerais, les procédés de fusion, la purification des métaux et les dangers liés aux vapeurs toxiques dans les mines. Bien qu'il ne se considère pas comme un chimiste, son travail repose sur une observation minutieuse et une description précise des phénomènes physiques et chimiques. 

L'intérêt croissant pour les plantes et les remèdes naturels pousse aussi à l'analyse des substances végétales. Les herboristes et apothicaires commencent à isoler certaines substances actives, bien qu'ils ne comprennent pas encore leur composition chimique. Les extraits alcooliques, les huiles essentielles et les teintures deviennent des outils courants en pharmacopée. La chimie commence ainsi à se distinguer de la simple préparation artisanale, même si elle reste étroitement liée à la médecine et à la magie naturelle. 

Enfin, le XVI^e siècle voit l'émergence d'un questionnement plus critique sur la nature de la matière. Certains penseurs commencent à remettre en cause les catégories aristotéliciennes, non pas par une approche expérimentale moderne, mais par une interprétation alchimique renouvelée. L'idée que la matière puisse être transformée par des processus intelligibles, reproductibles et utiles gagne du terrain. Ce changement de paradigme, lent et souvent contradictoire, pose les bases de la chimie moderne, même si celle-ci ne s'affranchira pleinement de ses racines alchimiques qu'au siècle suivant.