En 1893, elle commença à travailler à l'observatoire de Harvard sous la direction d'Edward Charles Pickering, intégrant l'équipe des "calculateurs humains". À cette époque, les femmes n'étaient pas autorisées à utiliser les télescopes, aussi leur travail consistait à mesurer et cataloguer la luminosité des étoiles à partir des plaques photographiques. Disposant de ressources financières indépendantes, elle ne fut d'abord pas rémunérée, puis elle toucha un salaire de 30 cents de l'heure. Sa carrière à Harvard fut marquée par des interruptions dues à des problèmes de santé; elle contracta une maladie après l'obtention de son diplôme qui entraîna une perte auditive progressive, faisant d'elle une personne sourde.

Pickering confia à Leavitt l'étude des étoiles variables, dont la luminosité varie avec le temps, en se concentrant sur les Nuages de Magellan. En examinant les plaques photographiques prises par l'astrographe Bruce à la station de l'observatoire de Harvard à Arequipa, au Pérou, elle identifia pas moins de 1777 étoiles variables. En 1908, elle publia ses résultats dans les Annals of the Astronomical Observatory of Harvard College, notant que quelques-unes de ces variables semblaient suivre une tendance : les plus brillantes présentaient des périodes de variation plus longues. Cette observation préliminaire la conduisit à une découverte fondamentale. En 1912, dans un article présenté par Edward Pickering mais clairement préparé par Henrietta Leavitt, elle confirma l'existence d'une relation précise et prévisible entre la période de pulsation des étoiles variables céphéides et leur luminosité intrinsèque. 

Ayant la certitude que toutes les étoiles des Nuages de Magellan se trouvaient à peu près à la même distance de la Terre, elle en déduisit que leurs différences de luminosité apparente reflétaient leurs différences de luminosité réelle. Elle établit ainsi que le logarithme de la période d'une céphéide est directement proportionnel à sa magnitude absolue moyenne. En d'autres termes, plus la période de pulsation d'une céphéide est longue, plus l'étoile est intrinsèquement brillante. Cette relation, connue depuis sous le nom de loi de Leavitt ou relation période-luminosité, fournissait aux astronomes la toute première chandelle standard : un outil fiable pour mesurer des distances astronomiques jusqu'alors inaccessibles. L'année suivant la publication de ses travaux, l'astronome Ejnar Hertzsprung parvint à calibrer cette relation en déterminant la distance de quelques céphéides au sein de notre Voie lactée, ce qui permit de l'utiliser pour calculer la distance des céphéides lointaines.

L'impact de la découverte de Leavitt fut immense et transforma profondément notre compréhension de l'univers. Quelques années plus tard, en 1923-1924, l'astronome Edwin Hubble utilisa précisément sa méthode en identifiant des céphéides dans la Grande nébuleuse d'Andromède. En appliquant la relation période-luminosité, il démontra qu'Andromède se trouvait à une distance bien trop grande pour faire partie de la Voie lactée, prouvant ainsi que ces "nébuleuses spirales" étaient en réalité des galaxies indépendantes. 

En 1921, Harlow Shapley, le nouveau directeur de l'observatoire, la nomma responsable de la photométrie stellaire. Atteinte d'un cancer de l'estomac, Henrietta Swan Leavitt s'éteignit le 12 décembre de la même année à Cambridge, dans le Massachusetts, à l'âge de 53 ans. Elle fut inhumée dans le caveau familial au cimetière de Cambridge. Son collègue Solon I. Bailey écrivit dans sa notice nécrologique qu'"elle avait l'heureuse faculté d'apprécier tout ce qui était digne et aimable chez les autres, et possédait une nature si pleine de soleil que, pour elle, toute la vie devenait belle et pleine de sens".  En 1924, le mathématicien Gösta Mittag-Leffler, membre de l'Académie royale des sciences de Suède, tenta de la nommer pour le prix Nobel, mais il apprit qu'elle était décédée  trois ans plus tôt. Le prix Nobel n'étant pas décerné à titre posthume, elle ne put jamais être honorée.